CUNICULTURE Magazine Volume 32 (année 2005) pages 63 à 69

ASFC 10 mars 2005 - Journée d'étude « Puebla - Ombres & Lumières »
Pathologie et Hygiène
au 8^ème Congrès Mondial de Cuniculture

par Pierre Coudert et Dominique Licois
INRA, Unité BASE, Centre de Recherches de Tours, 37380 Nouzilly

Compte tenu de l'importance du sujet et de la préoccupation des éleveurs, au moins en Europe, on peut s'étonner du petit nombre de communications faites sur l'EEL (3 + la présentation de synthèse). Il est vrai que lors de la table ronde sur les entéropathies du lapin, animée par Badiola (Espagne), une grande partie de la discussion a été dévolue à cette pathologie.

Dans son rapport de synthèse D. LICOIS [12] a fait le point sur les dernières avancées obtenues depuis le congrès de Valence (2000). L'obtention d'un inoculum de référence (TEC), a permis de caractériser précisément l'EEL (cinétique de la maladie, signes cliniques, lésions macroscopiques…) et de confirmer l'absence de spécificité, voire l'absence tout court, des lésions histologiques, qui s'avèrent donc inutilisables en terme de diagnostic. Avec l'appui de différents partenaires, la caractérisation de l'inoculum au niveau parasitaire, bactériologique et virologique a permis d'écarter un certain nombre d'hypothèses étiologiques.

En ce qui concerne l'étiologie, bien que des rotavirus aient été identifiées, ils ne sont probablement pas les agents primaires responsables de la maladie. L'autre germe retrouvé est Clostridium pefringens. Une coopération avec une équipe belge (D. Marlier et H. Vindevogel) ciblée sur le rôle de cette bactérie et de ses toxines alpha et béta2, a été engagée mais aucun résultat univoque n'est venu étayer cette hypothèse pour le moment. De même, une firme privée (Proteus) a développé un programme d'identification de l'agent pathogène de l'EEL, par différentes approches de biologie moléculaire. Des pistes sur l'intervention possible de clostridiales d'une part ou d'une famille de virus d'autre part, ont été énoncées mais sans résultats tangibles ultérieurs. Néanmoins lors de la table ronde, Badiola a mentionné que sur 4 souches de Clostridium pefringens isolées de lapins atteints d'EEL, l'une d'entre elles avait reproduit des symptômes d'EEL et entraîné jusqu'à 50% de mortalité. Une autre bactérie dont le nom n'a pas été cité, pourrait également intervenir dans l'étiologie de l'EEL. Il serait particulièrement intéressant de voir comment se comportent ces germes dans nos conditions expérimentales (lapins EOPS - Exempts d'Organisme Pathogènes Spécifiés) et de vérifier si ces bactéries sont présentes dans notre inoculum ou dans ceux obtenus par d'autres équipes.

Des indications concernant aussi l'étiologie ont été présentées par COUDERT et LICOIS [10] qui ont analysé les évènements précoces survenant lors de reproductions expérimentales de l'EEL. Une chute significative mais transitoire du gain de poids est observée moins de 20h après l'inoculation des animaux, y compris chez ceux traités au Bacivet S et qui n'ont pas développé d'EEL. Ces auteurs suspectent l'intervention possible d'une toxine présente dans l'inoculum pour expliquer ce phénomène.

L'action de la bacitracine soluble dans l'eau de boisson (Bacivet S®) a été comparée à celle préalablement utilisée en supplémentation dans l'aliment (Albac®), chez des lapins conventionnels inoculés avec l'inoculum TEC3 [6]. Le Bacivet S (à 0.675 g/l) donne d'aussi bons résultats que l'Albac à 100 ppm, si l'utilisation est faite en préventif : réduction significative de la morbidité et de la mortalité comparativement aux animaux inoculés non traités. Par contre, en curatif le traitement au Bacivet S, bien que réduisant aussi morbidité et mortalité, est moins efficace.

Soulignons un autre travail qui n'a pas été réalisé dans le cadre strict de l'EEL mais dont l'application parait tout aussi utile pour cette pathologie. Il s'agit de la restriction hydrique [16]. Il avait déjà été montré les effets bénéfiques d'une restriction alimentaire (entre 60 et 80%) de l'ad libitum sur la réduction de la mortalité et de la morbidité, en situation d'EEL ou non. Ici, l'étude a été réalisée dans un élevage qu'on peut supposer comme ayant des problèmes digestifs. La méthode proposée a consisté à laisser l'accès à l'eau de boisson pendant un courte période de la journée (ici 2h30) ce qui a induit indirectement une restriction alimentaire de l'ordre de 83% de l'ad libitum. Comparativement à une restriction alimentaire vraie, la restriction hydrique a réduit la mortalité (9.3% vs 19.3%). Dommage qu'il n'y ait pas eu de lot témoin qui aurait pu préciser le taux de mortalité en l'absence de restriction hydrique ou alimentaire, ni d'analyse de la morbidité (GMQ par exemple).

Enfin dans la session génétique, DE ROCHAMBEAU et al. [14] ont rapporté des résultats concernant un programme sur la résistance génétique aux entéropathies du lapin, incluant l'EEL. Dans cette communication a été analysée la variabilité génétique de lapereaux, issus de 48 mâles, soumis à trois modèles de pathologie digestive expérimentale (coccidiose, EEL et pathologie non spécifique provoquée par une réduction du taux de fibres alimentaires). Plusieurs indices ont permis de caractériser la réponse individuelle des animaux. Pour chaque modèle un effet significatif des mâles sur certains indices a été démontré. Ces résultats montrent l'existence d'une variabilité génétique pour la résistance aux 3 modèles étudiés. Signalons que des travaux sont poursuivis actuellement plus spécifiquement sur l'EEL.

Les colibacilloses demeurent avec l'EEL l'une des pathologies dominantes actuellement en élevage. Essentiellement dus aux Escherichia coli appartenant à la catégorie des EPEC (enteropathogenic E. coli), certains pathovars sont responsables de pertes importantes après sevrage mais parfois aussi avant sevrage. Plusieurs auteurs ont rappelé les avancées obtenues ces dernières années sur la connaissance des mécanismes de pathogénicité et l'identification des facteurs de virulence et l'utilisation qui pouvait en être faite en termes de diagnostic, d'épidémiologie ou de prophylaxie vaccinale.

En plus du rapport introductif de LICOIS [12], 11 communications sur les 44 de la session pathologie font référence aux E. coli intestinaux (soit 27%), c'est dire l'importance de cette bactérie, au moins en termes d'objet de recherche ou d'étude. C'est en tout cas nettement plus que les quelques communications produites dans ce domaine lors des 2 précédents congrès (Valence : 3, Toulouse : 2).

Les communications ont été regroupées en 3 catégories
    - celles qui s'intéressent au diagnostic et à l'épidémiologie
    - celles qui traitent de vaccination à partir de souches mutées
    - et les diverses : enquêtes terrain, abattoir, traitements…

Illustration histologique d'une lésion d'effacement

Rappel sur la pathogénicité, les facteurs de virulence et les mécanismes moléculaires mis en jeu [12]

Les EPEC ainsi que les EHEC (enterohemorrhagic E. coli) induisent des lésions spécifiques d'attachement-effacement à la surface des cellules épithéliales intestinales de l'iléon du cæcum et du côlon qui sont les segments intestinaux concernés par les EPEC chez le lapin. Ces lésions sont caractérisées par un attachement intime des bactéries au niveau de la bordure en brosse des entérocytes et par la formation de structures appelées "piedestals" dans lesquels sont enchâssées les bactéries.
Les connaissances acquises depuis le début des années 1990 sur les facteurs de virulence des EPEC résultent des travaux réalisés in vivo et in vitro (cultures cellulaires) à partir de souches entéropathogènes du lapin (Milon, Peeters, Blanco…) ou d'une souche EPEC humaine de référence.

De manière synthétique un modèle en trois étapes a été proposé.
La première étape correspond à une adhésion modérée médiée par des protéines fimbriales, facteurs d'attachement codés par des plasmides et appelées adhésines. Elles permettent aux bactéries de coloniser le tractus intestinal et de s'opposer aux mécanismes de résistance non spécifiques comme le péristaltisme. Chez le lapin, deux adhésines ont été décrites : la première AF/R1 chez une souche O-15 et la seconde AF/R2 chez les souches EPEC O-103.
Le deuxième et le troisième stades conduisent à un contact étroit entre la bactérie et la cellule cible, l'enterocyte. Ils impliquent plusieurs protéines codées par des gènes chromosomiques responsables des lésions d'attachement effacement, localisés dans un îlot de pathogénicité le Locus d'Entéro Effacement (LEE). Le LEE code pour différentes protéines ayant une grande diversité de fonctions. La plupart d'entre elles sont secrétées via un système de sécrétion de type III (TTSS). Dans la région centrale du LEE, le gène eae code pour une protéine de membrane externe, l'intimine qui se fixe sur son récepteur Tir (translocated intimin receptor) et établit ainsi un contact étroit entre la bactérie et l'entérocyte. Tir est secrété par le TTSS et transloqué (injecté dans la cellule hôte) à travers la membrane cellulaire par l'intermédiaire d'une "seringue moléculaire" qui comprend plusieurs effecteurs, EspA, EspB and EspD, (E. coli secreted proteins). Toutes ces protéines sont nécessaires pour activer un signal qui conduira aux lésions d'attachement-effacement et aux perturbations physiopathologiques associées à la diarrhée.

C'est ce qu'ont essayé d'évaluer Bohez et al. [3, 4, 5] qui ont travaillé sur deux autres souches entéropathogènes du lapin : une souche d'E. coli O-15 délétée dans le gène eae et une souche O-132 délétée dans le gène tir. Rappelons que les souches O-15 dominent en Belgique, alors qu'en France ou en Italie les souches O-103 sont les plus fréquentes.

La souche mutée O-15 D eae a été utilisée en condition de terrain dans un élevage où sévissaient des problèmes de colibacillose associés à l'entéropathie épizootique [3] . En administrant la souche vaccin à des lapins de certaines cages, les auteurs ont d'abord cherché à savoir si cette souche était capable de diffuser aux animaux non vaccinés des cages voisines. Le résultat a été négatif. La conclusion est qu'il est nécessaire de vacciner l'ensemble des animaux. Le deuxième objectif était de vérifier l'efficacité de la vaccination. Aucune différence n'a été montrée entre le lot vacciné et le lot non vacciné en ce qui concerne les paramètres zootechniques et cliniques enregistrés (mortalité moyenne 20%, morbidité moyenne 26%). Dans les deux lots ont été retrouvés les sérogroupes O-109 (EPEC rencontrés chez les lapereaux avant sevrage) et O-132. Ceci rejoint les résultats obtenus en 2003 par cette équipe, avec la même souche O-15 D eae, mais en condition expérimentale cette fois. Elle avait démontré que cette souche protégeait bien vis-à-vis de souches sauvages homologues O-15 alors qu'elle confirme ici que la protection contre des souches hétérologues O-132 ou O-109 n'est pas totalement satisfaisante.

Dans une autre présentation, intéressante sur le plan pratique, ces mêmes auteurs [5] ont testé différentes modalités d'administration de la souche atténuée O-15 D eae (per os, via l'eau de boisson, par pulvérisation sur aliment ou directement sur le poil des animaux). Ils ont ensuite vérifié expérimentalement son efficacité par une inoculation d'épreuve avec une souche sauvage O-15. Dans tous les cas de figures la souche vaccin s'implante bien et diminue l'excrétion de la souche sauvage après challenge. Par contre la virulence modérée de la souche sauvage utilisée dans cet essai ne permet pas d'apprécier l'efficacité réelle de la vaccination sur l'expression de la pathologie.

La deuxième souche atténuée O-132 D tir, étudiée par Bohez et al. [4] , dérive d'une souche sauvage O-132, considérée comme moins pathogène que les E. coli O-103 ou O-15. L'objectif était précisément ici de tester expérimentalement la protection croisée de cette souche vaccinale vis-à-vis de souches virulentes hétérologues O-15 et O-103. Les résultats obtenus montrent que la protection a été bonne contre la souche O-15 mais insuffisante vis-à-vis de la souche O-103.

La conclusion générale sur ces souches mutées est qu'expérimentalement on a de bons résultats de protection face aux pathotypes dont sont issues directement les souches vaccinales, mais il reste à trouver un vaccin polyvalent qu'il faudra aussi valider sur le terrain (pourquoi pas une association de différentes constructions comme le propose Bohez et al. [4] ).

Diagnostic et épidémiologie

Ce domaine a été abordé dans quatre communications émanant essentiellement d'auteurs italiens (Agnoletti et al. [1] , Camarda et al. [8] , D'Incau et al . [11] , Pisoni et al. [13] ) . Tous se sont intéressés à caractériser des souches d' E. coli isolées de lapins atteints de troubles digestifs. Les critères utilisés sont le sérogroupage (identification de l'antigène somatique O), biotypage (aptitude à fermenter certains sucres), profil d'antibiorésistance et certains facteurs de virulence : recherche du gène eae ou de gènes codant pour des toxines. Là aussi les avancées de la biologie moléculaire ont été utilisées. La plupart des auteurs ont inclus le gène eae comme outil de diagnostic pour identifier les souches virulentes afin d'évaluer la prévalence des colibacilloses sur le terrain, dans différentes régions de l'Italie. Je citerai un seul exemple, représentatif a mon sens, puisqu'il concerne plus de 2000 souches d' E. coli isolées d'élevages intensifs de l'ensemble de l'Italie et analysées pour le gène eae [1] : selon ces auteurs, la prévalence des EPEC avait régressé en Italie entre 1999 et 2000, pour s'accroître depuis, avec 45% des souches possédant le gène eae. Cependant il faut rester prudent car des travaux français réalisés il y a une dizaine d'années avaient montré que le gène eae pouvait être identifié chez des souches O-103 non pathogènes. Les sérogroupes les plus fréquemment rencontrés sont O-103 et O-2 [11] . Enfin, alors que les souches isolées possèdent de nombreux profils d'antibiorésistance, la sensibilité aux quinolones (notamment la marbofloxacine) reste importante [8, 13] .

Autres travaux

Badiola et al. [2] se sont appuyés sur des techniques utilisées en biologie moléculaire notamment la RFLP (restriction fragment length polymorphysm) pour différencier des profils de flores microbiennes chez des lapins malades comparativement à des lapins sains. En utilisant 5 enzymes de restriction appliquées à un fragment du gène ribosomal bactérien 16S, amplifié par PCR à partir de contenu intestinal, ces auteurs ont observé des profils RFLP caractéristiques de disfonctionnements intestinaux associés à l'entéropathie épizootique, aux colibacilloses, aux clostridioses ou même à des modifications liées à l'antibiothérapie. Ces profils sont ensuite introduits dans une base de données conçue et gérée par les auteurs. L'intérêt de ce type d'approche est multiple : il permet de s'intéresser à des bactéries non cultivables, de mieux appréhender des écosystèmes complexes comme celui de la flore microbienne intestinale, et enfin d'utiliser la base de donnée comme outils d'aide au diagnostic.

Le papier de Cerone et al. [9] avait pour objet la recherche d'agents principalement bactériens responsables potentiels de zoonoses (Salmonelles, Lysteria, Campylobacter,….), au niveau des 5 abattoirs de la région de la Campanie en Italie. E. coli, entre autres, a été inclus comme marqueur des qualités hygiéniques. En effet cette bactérie, essentiellement présente dans l'intestin, peut se retrouver sur les carcasses, voire dans l'environnement après éviscération des animaux. Elle peut donc constituer un bon marqueur des pratiques utilisées, et donc de l'hygiène, tout au long de la chaîne d'abattage. Les auteurs ont effectivement trouvé des abattoirs où une proportion élevée de prélèvements contenait beaucoup [trop] d'E. coli : plus de 10 000 /g (voir figure ci-contre)

Un dernier travail présenté par Tsalie et al. [15] a consisté à évaluer l'incidence de la vitamine E sur les caractères morphométriques des villosités intestinales de l'iléon ainsi que sur les leucocytes intraépithéliaux, lors d'une colibacillose expérimentale (souche O-103 Rh- E22). La vitamine E est connue pour stimuler la réponse immunitaire dans un certain nombre d'affections. L'inoculation des colibacilles seule entraîne une réduction de l'épaisseur de la muqueuse et de la hauteur des villosités A l'inverse, une amélioration significative de ces paramètres est observée lorsque l'inoculation est associée à l'administration de vitamine E. De même les mononucléaires et les polynucléaires de la lamina propria sont plus élevés chez les lapins inoculés recevant la vitamine E par rapport aux animaux inoculés non traités, ce qui rend compte d'une réaction inflammatoire plus intense. Par contre, il n'a pas pu être mis en évidence de différence significative entre les 2 groupes d'animaux, concernant l'évolution de la maladie (GMQ, diarrhée,…). Dans cette étude, malgré un effet bénéfique au niveau intestinal, l'incidence d'une supplémentation en vitamine E semble minime pour accroître la résistance des animaux à la colibacillose.